TEST ELISA

A.  Pengertian Elisa

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel.

B.  Alat yang di gunakan yaitu Mini Vidas 

Alat mini vidas adalah salah satu alat yang digunakan untuk pemeriksaan imunologi. Prinsip alat ini merupakan modifikasi dari prinsip ELISA yang pembacaannya berdasarkan fluoresensi.

C.  Komponen-komponen mini vidas

1.      Tombol on/off

2.      Tray

Berfungsi sebagai tempat untuk memasukkan strip yang berisi sampel dan  reagen.

3.      Display (Layar)

                    Berfungsi sebagai tempat untuk menampilkan program pada alat.

4.      Printer

5.      Inkubator

Berfungsi untuk proses inkubasi pada pemeriksaan, agar reaksi lebih sempurna biasanya            pada suhu 37⁰C

D.  SISTEM YANG DIGUNAKAN PADA UJI VIDAS

Ø  Sistem VIDAS uji menggunakan sistem reagen Strip.

Ø  SPR (Wadah Fase Padat) dilapisi dengan antigen atau antibodi.

Ø  Strip berisi semua reagen yang diperlukan untuk reaksi.
SPR bertindak sebagai pipetting dan perangkat reagen transfer.

Ø  Pada setiap tahap reaksi, maka aspirasi reagen masuk dan keluar. Ini untuk mencegah kontaminasi antar-reagen atau antar-sampel.

E.   Prosedur pengoperasian mini vidas:

1.      Sambungkan UPS pada listrik. Nyalakan UPS.

2.      Tekan tombol on/off yang terdapat pada bagian  belakang alat.

3.      Alat akan melakukan inisialisasi/warming up kurang lebih 10 menit.

4.      Setelah selesei, pada layar akan muncul menu utama sebagai berikut:

5.      Pilih “STATUS SCREEN” untuk masuk pada program pemeriksaan.

                                   

F.    KALIBRASI KONTROL DAN SAMPEL

1.      Letakkan strip dan SPR pada section yang dikehendaki (misal:section A)

2.      Pilih “STATUS SCREEN” pada menu utama.

3.      Pilih section yang dkehendaki (misal:section A).

4.      Pilih posisi A1 (dengan menekan angka 1 pada keypad)

5.      Pilih S dan angka 1 pada keypad (S1 untuk posisi A1), lalu tekan enter.

Pilih S dan angka 1 pada keypad (S1 untuk posisi A2), lalu tekan enter

Pilih S dan angka 1 pada keypad (S1 untuk posisi A3), apabila kalibrasi triplo, lalu tekan enter.

6.      Pilih C dan angka 1 pada keypad (C1 untuk posisi A4), lalu tekan enter

Pilih Cdan angka 2 pada keypad (C2 apabila ada, untuk posisi A5) lalu tekan enter.

7.      Pilih sampel ID (pasien untuk posisi A6)

8.      Masukkan sampel ID pasien tersebut (max 12 huruf/angka), lalu tekan enter.

9.      Setelah selesei tekan start.

10.  Alat tersebut akan mengkalibrasi sendiri.

G.     Hal-hal yang perlu diperhatikan:

1.      Pemeriksaan dengan reagen baru terlebih dahulu MLE pada secara otomatis

2.      SPR dan strip reagents yang digunakan harus sama

3.      Setiap 1 SPR dan 1 strip reagen hanya untuk satu test

4.      Kalibrasi dan running control dilakukan setiap 2 minggu sekali

5.      Setelah selesai digunakan mini vidas dapat langsung dimatikan tanpa harus melalui prosedur khusus

KROMATOGRAFI

PENGERTIAN KROMATOGRAFI

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan. Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam. Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah. Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom.

Kromatografi dapat dibedakan atas berbagai macam tergantung pada pengelompokannya.Contoh pada mekanisme pemisahannya kromatografi dibedakan menjadi berdasarkan pada alat yang dignakn kromatografi dibedakan atas

a. kromatografi lapis tipis

b. kromatografi penukar ion

c. Kromatografi Penyaringan Gel

d. Kromatografi Elektroforesis

e. Kromatografi kertas

f. kromatografi gas

Macam-macam kromatografi :

a. Kromatografi Lapis Tipis

         Yaitu kromatografi yang menggunakan lempeng gelas atau alumunium yang dilapisi dengan lapisan tipis alumina, silika gel, atau bahan serbuk lainnya. Kromatografi lapis tipis pada umumnya dijadikan metode pilihan pertama pada pemisahan dengan kromatografi.

b. Kromatografi Penyaringan Gel

Merupakan proses pemisahan dengan gel yang terdiri dari modifikasi dekstran-molekul polisakarida linier yang mempunyai ikatan silang. Bahan ini dapat menyerap air dan membentuk susunan seperti saringan yang dapat memisahkan molekul-molekul berdasarkan ukurannya. Molekul dengan berat antara 100 sampai beberapa juta dapat dipekatkan dan dipisahkan. Kromatografi permeasi gel merupakan teknik serupa yang menggunakan polistirena yang berguna untuk pemisahan polimer.

C. Elektroforesis

Merupakan kromatografi yang diberi medan listrik disisinya dan tegak lurus aliran fasa gerak. Senyawa bermuatan positif akan menuju ke katode dan anion menuju ke anoda. Sedangkan kecepatan gerak tergantung pada besarnya muatan.

1.KROMATOGRAFI KERTAS

Kromatografi kertas merupakan salah satu metode pemisahan berdasarkan distribusi suatu senyawa pada dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Pemisahan sederhana suatu campuran senyawa dapat dilakukan dengan kromatografi kertas, prosesnya dikenal sebagai analisis kapiler dimana lembaran kertas berfungsi sebagai pengganti kolom.

Kromatografi kertas adalah salah satu pengembangan dari kromatografi partisi yang menggunakan kertas sebagai padatan pendukung fasa diam. Oleh karena itu disebut kromatografi kertas. Sebagai fasa diam adalah air yang teradsorpsi pada kertas dan sebagai larutan pengembang biasanya pelarut organik yang telah dijenuhkan dengan air.

Dalam kromatografi kertas fasa diam didukung oleh suatu zat padat berupa bubuk selulosa. Fasa diam merupakan zat cair yaitu molekul H2O yang teradsorpsi dalam selulosa kertas.fasa gerak berupa campuran pelarut yang akan mendorong senyawa untuk bergerak disepanjang kolom kapiler. Analisis kualitatif menggunakan kromatografi kertas dilakukan dengan cara membandingkan harga relative response factor (Rf). Nilai Rf identik dengan time retention (tR) atau volume retention (VR).
Nilai Rf dapat ditentukan dengan cara:

Rf = jarak yang ditempuh noda jarak yang ditempuh pelarut.

Harga Rf zat baku dapat diidentifikasikan komponen campuran, karena harga besaran ini bersifat khas untuk setiap zat asal digunakan jenis pengembang yang sama. Kadang-kadang pemisahan dalam satu arah belum memberikan hasil yang memuaskan. Untuk mendapatkan hasil yang lebih baik, dapat dipakai cara kromatografi kertas dua dimensi, yang mana letak kertas diubah sehingga arah pemisahan juga berubah.

Secara umum kromatografi kertas dilakukan dengan menotolkan larutan yang berisi sejumlah komponen pada jarak 0,5 sampai 1cm dari tepi kertas. Setelah penetesan larutan pada kertas, maka bagian bawah kertas dicelupkan dalam larutan pengambang(developing solution). Larutan ini umumnya terdiri atas campuran beberapa pelarut organik yang telah dijenuhkan dengan air.

Sistem ini akan terserap oleh kertas dan sebagai akibat dari gaya kapiler akan merambat sepanjang kertas tersebut. Rambatan ini dapat diusahakan dalam modus naik atau menurun. Selama proses pemisahan dilakukan, sistem secara keseluruhannya disimpan dalam tempat tertutup, ruang didalamnya telah jenuh dengan uap sistem pelarut ini.

Kromatografi gas Campuran gas dapat dipisahkan dengan kromatografi gas. Fasa stationer dapat berupa padatan (kromatografi gas-padat) atau cairan (kromatografi gas-cair). Umumnya, untuk kromatografi gas-padat, sejumlah kecil padatan inert misalnya karbon teraktivasi, alumina teraktivasi, silika gel atau saringan molekular diisikan ke dalam tabung logam gulung yang panjang (2-10 m) dan tipis. Fasa mobil adalah gas semacam hidrogen, nitrogen atau argon dan disebut gas pembawa. Pemisahan gas bertitik didih rendah seperti oksigen, karbon monoksida dan karbon dioksida dimungkinkan dengan teknik ini. Dalam kasus kromatografi gas-cair, ester seperti ftalil dodesilsulfat yang diadsorbsi di permukaan alumina teraktivasi, silika gel atau penyaring molekular, digunakan sebagai fasa diam dan diisikan ke dalam kolom. Campuran senyawa yang mudah menguap dicampur dengan gas pembawa disuntikkan ke dalam kolom, dan setiap senyawa akan dipartisi antara fasa gas (mobil) dan fasa cair (diam) mengikuti hukum partisi. Senyawa yang kurang larut dalam fasa diam akan keluar lebih dahulu Metoda ini khususnya sangat baik untuk analisis senyawa organik yang mudah menguap seperti hidrokarbon dan ester. Analisis minyak mentah dan minyak atsiri dalam buah telah dengan sukses dilakukan dengan teknik ini. Efisiensi pemisahan ditentukan dengan besarnya interaksi antara sampel dan cairannya. Disarankan untuk mencoba fasa cair standar yang diketahui efektif untuk berbagai senyawa. Berdasarkan hasil ini, cairan yang lebih khusus kemudian dapat dipilih. Metoda deteksinya, akan mempengaruhi kesensitifan teknik ini. Metoda yang dipilih akan bergantung apakah tujuannya analisik atau preparatif. HPLC (high precision liquid chromatography atau high performance liquid chromatography) Akhir-akhir ini, untuk pemurnian (misalnya untuk keperluan sintesis) senyawa organik skala besar, HPLC (high precision liquid chromatography atau high performance liquid chromatography) secara ekstensif digunakan. Bila zat melarut dengan pelarut yang cocok, zat tersebut dapat dianalisis. Ciri teknik ini adalah penggunaan tekanan tinggi untuk mengirim fasa mobil kedalam kolom. Dengan memberikan tekanan tinggi, laju dan efisiensi pemisahan dapat ditingkatkan dengan besar. Silika gel atau oktadesilsilan yang terikat pada silika gel digunakan sebagai fasa stationer. Fasa stationer cair tidak populer. Kolom yang digunakan untuk HPLC lebih pendek daripada kolom yang digunakan untuk kromatografi gas. Sebagian besar kolom lebih pendek dari 1 m. Kromatografi penukar ion menggunakan bahan penukar ion sebagai fasa diam dan telah berhasil digunakan untuk analisis kation, anion dan ion organik. 2.KROMATOGRAFI GAS A.Teori Kromatografi Gas Kromatografi gas termasuk dalam salah satu alat analisa (analisa kualitatif dan analisa Ckuantitatif), kromatografi gas dijajarkan sebagai cara analisa yang dapat digunakan untuk menganalisa senyawa-senyawa organic. Kita telah mengetahui bahwa ada dua jenis kromatografi gas, yatiu kromatografi gas padat (KGP), dan kromatografi gas cair (KGC). Dalam kedua hal ini sebagai fasa bergerak adalah gas (hingga keduanya disebut kromatografi gas), tetapi fasa diamnya berbeda. Meskipun kedua cara tersebut mempunyai banya persamaan. Perbedaan antara kedunya hanya tentang cara kerja.

Densitometer, Blood Gas Analyzer & Autoanalyzer

A. Densitometer

Adalah alat yang didesign untuk mengukur denstitas optik. Densitometer bisa digunakan untuk mengukur densitas tinta printer atau densitas optik sebuah film.

Macam densitometer ada 2 jenis:

1. Reflection Densitometer

Densitometer adalah sebuah cara untuk membaca sinar yang direfleksikan oleh permukaan objek oleh sel fotoelektrik atau detector.

2. Transmision Densitometer

Densitometer transmisi adalah sebuah cara untuk membaca sinar yang melewati objek transparan oleh sel fotoelektrik atau detector artinya sinar yang ditransmisikan melalui objek.

Komponen – komponen densitometer

• Sumber cahaya yang stabil
• Komponen optik untuk memfokuskan sinar agar sinar jatuh tepat pada sampel
• Penyaring untuk menentukan respon spectral unit
• Detector untuk membaca sinar yang direfleksikan
• Logarithmic Amplifier
• Layar display

Mekanisme Kerja

B. Blood Gaz Analyzer

Adalah alat yang digunakan untuk menentukan konsentrasi gas yang ada di dalam darah seperti CO2 dan O2, mengukur pH dan mengukur elektrolit seperti potasium, natrium, zat kapur serta klorid.

Komponen- komponen Blood Gas Analyzer:

• Ion Selective Electrode modules
• Reagent chambers
• Humidifier wells
• Sample Input port
• Peristaltic Pump
• Waste module

Dalam Ion Selective Electrode modules terdapat:

•pH modules

Memproduksi berbagai tingkatan keluaran yang sebanding dengan pH sampel yang sedang dianalisa

• pCO2 modules

Memproduksi voltase yang sebanding dengan konsentrasi CO2 pada sampel.

• pO2 modul

Menghasilkan voltase yang sebanding dengan konsentrasi O2 pada sampel.

• Acuan Electroda

Menyediakan potensial elektrik yang konstan dan stabil (756mV) yang digunakan sebagai petunjuk untuk mengukur potensial elektrik yang diproduksi oleh setiap pengukuran elektroda.

•Heater menjaga/mempertahankan standar elektroda pada suhu 370C

• Sensor suhu Menunjukan temperatur ketika suhu turun atau naik 2 derajat di atas 370C

• Airflow detector berada di tempat masuk atau keluar dari standar elektrooda. Memeriksa adanya udara atau cairan di dalam tabung sampel.

-->Sumber cahaya menghasilkan sinar yang akan melewati tubing ke fotodetektor

-->Fotodetektor dimonitor oleh uP yang memonitor detector udara/cairan jadi dapat mendeteksi pompa peristaltic ketika mulai atau berhenti.

Reagen Standar

• Tempat reagen standar dari dua larutan digunakan untuk mengkalibrasi pH eleektroda dan larutan pencuci.
• Ada dua larutan yang bisa digunakan untuk mengkalibrasi pH elektroda selama proses kalibrasi
• Larutan pencuci digunakan untuk mencuci sampel setelah dianalisis.

Humidifier digunakan untuk menjenuhkan gas yang akan digunakan untuk mengkalibrasi elektroda pO2 dan pCO2 dengan air.

C. Autoanalyzer

Adalah alat yang memiliki presisi tinggi dan mudah digunakan dan digunakan untuk mengotomatisasi pemeriksaan kimia basah tradisional.

Menurut cara kejanya, autoanalyzer dibagi menjadi 2:

1. Continous Flow Analyzer (CFA) : Prinsipnya, gelembung udara membawa sampel ke tiap ruangan pemeriksaan dalam mesin untuk kemudian dianalisa. Metode ini bisa ddipercaya untuk memeriksa 90 sampel per jam. Meskipun pada saat melewati batas kuota pemeriksaan per jam dapat meningkatkan cross contamination.
2. Flow Injection Analyzer (FIA) : Prinsip kerjanya, tiap sampel dilarutkan dalam pelarut masing masing untuk kemudian dimasukkan kedalam mesin. Udara tidak mengambil peran dalam sistem ini. Bagian dari sampel dimasukkan kedalam ruang pemeriksaan untuk kemudian diperiksa. Meskipun sistem ini memilii berbagai macam keterbatasan namun sistem ini memberi jalan kepada produsen untuk memperkecil ukuran autoanalyzer.

Komponen

• Sampler : Berfungsi memasukkan sampel pada reagen dari analytical cartridge secara otomatis menggunakan sebuah probe yang otomatis bergerak diantara sampel dan cairan pencuci dengan interval waktu yang tepat. Sampel ditampung pada tabung atau sample cups.
• Micropump : Berfungsi memindahkan sampel dan reagen bersama kedalam anlalytical cartridge menggunakan gerak peristaltic yang dihasilkan oleh pump tersebut.
• Cartridge Base & Analytical Cartridge
• Docking Photometer base : Instrumen ini menyediakan arus listrik DC yang teratur yang mampu menyuplai 3 buah fotometer dengan kebutuhan 305A. Instrumen ini menyediakan sumber cahaya kepada fotometer
• Digital Detector : Berfungsi mengukur absorbance dari produk berwarna yang dihasilkan oleh reaksi antara sampel dan reagen. Digital detector ini mengubah sinyal dari absorbance tersebut menjadi sinyal elektronik digital
• Data Acquisition system : Berfungsi menyediakan hardware control dan “data reduction” dari 8 detector secara simultan. Ini merupakan aplikasi yang terintegrasi dengan windows
• Surfactants : Berfungsi menurunkan tegangan permukaan dari “flow stream” dam menurunkan tekanan balik dari analyzing cartridge. Ini membuat bubble injection dan fluid flow untuk mengalir secara lembut dan lancar.

SPEKTROFOTOMETER

SPEKTROFOTOMETER

Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukur absorbansi dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatu obyek kaca atau kuarsa yang disebut kuvet. Sebagian dari cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan. Nilai absorbansi dari cahaya yang dilewatkan akan sebanding dengan konsentrasi larutan di dalam kuvet.

Jenis-jenis

Spektrofotometer dibagi menjadi dua jenis yaitu spektrofotometer single-beam dan spektrofotometer double-beam Perbedaan kedua jenis spektrofotometer tersebut hanya pada pemberian cahaya, dimana pada single-beam, cahaya hanya melewati satu arah sehingga nilai yang diperoleh hanya nilai absorbansi dari larutan yang dimasukan. Berbeda dengan single-beam, pada spektrofotometer double-beam, nilai blanko dapat langsung diukur bersamaan dengan larutan yang diinginkan dalam satu kali proses yang sama. Prinsipnya adalah dengan adanya chopper yang akan membagi sinar menjadi dua, dimana salah satu melewati blanko (disebut juga reference beam) dan yang lainnya melewati larutan (disebut juga sample beam). Dari kedua jenis spektrofotometer tersebut, spektrofotometer double-beam memiliki keunggulan lebih dibanding single-beam, karena nilai absorbansi larutannya telah mengalami pengurangan terhadap nilai absorbansi blanko. Selain itu, pada single-beam, ditemukan juga beberapa kelemahan seperti perubahan intensitas cahaya akibatfluktuasi voltase. 

Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia analisis yang digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. Peralatan yang digunakan dalam spektrofotometri disebut spektrofotometer. Cahaya yang dimaksud dapat berupa cahaya visibel, UV dan inframerah, sedangkan materi dapat berupa atom dan molekul namun yang lebih berperan adalah elektron valensi.

         Sinar atau cahaya yang berasal dari sumber tertentu disebut juga sebagai radiasi elektromagnetik. Radiasi elektromagnetik yang dijumpai dalam kehidupan sehari-hari adalah cahaya matahari.

        Dalam interaksi materi dengan cahaya atau radiasi elektromagnetik, radiasi elektromagnetik kemungkinanan dihamburkan, diabsorbsi atau dihamburkan sehingga dikenal adanya spektroskopi hamburan, spektroskopi absorbsi ataupun spektroskopi emisi.

         Pengertian spektroskopi dan spektrofotometri pada dasarnya sama yaitu di dasarkan pada interaksi antara materi dengan radiasi elektromagnetik. Namun pengertian spektrofotometri lebih spesifik atau pengertiannya lebih sempit karena ditunjukan pada interaksi antara materi dengan cahaya (baik yang dilihat maupun tidak terlihat). Sedangkan pengertian spektroskopi lebih luas misalnya cahaya maupun medan magnet termasuk gelombang elektromagnetik.

           Radiasi elektromagnetik memiliki sifat ganda yang disebut sebagai sifat dualistik cahaya yaitu:

1) Sebagai gelombang

2) Sebagai partikel-partikel energi yang disebut foton.

            Karena sifat tersebut maka beberapa parameter perlu diketahui misalnya panjang gelombang, frekuensi dan energi tiap foton. Panjang gelombang (l) didefinisikan sebagai jarak antara dua puncak.

Dari 4 jenis spektrofotometri ini (UV, Vis, UV-Vis dan Ir) memiliki prinsip kerja yang sama yaitu “adanya interaksi antara materi dengan cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu”. Perbedaannya terletak pada panjang gelombang yang digunakan.

Secara sederhana Instrumen spektrofotometri yang disebut spektrofotometer terdiri dari :

sumber cahaya – monokromator – sel sampel – detektor – read out (pembaca).

Fungsi masing-masing bagian:

1. Sumber sinar polikromatis berfungsi sebagai sumber sinar polikromatis dengan berbagai macam rentang panjang gelombang. Untuk sepktrofotometer

·         UV menggunakan lampu deuterium atau disebut juga heavi hidrogen

·         VIS menggunakan lampu tungsten yang sering disebut lampu wolfram

·         UV-VIS menggunan photodiode yang telah dilengkapi monokromator.

·         Infra merah, lampu pada panjang gelombang IR.

2. Monokromator berfungsi sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu mengubah cahaya yang berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi cahaya monaokromatis. Jenis monokromator yang saat ini banyak digunakan adalan gratting atau lensa prisma dan filter optik.

Jika digunakan grating maka cahaya akan dirubah menjadi spektrum cahaya. Sedangkan filter optik berupa lensa berwarna sehingga cahaya yang diteruskan sesuai dengan warnya lensa yang dikenai cahaya. Ada banyak lensa warna dalam satu alat yang digunakan sesuai dengan jenis pemeriksaan.

Pada gambar di atas disebut sebagai pendispersi atau penyebar cahaya. dengan adanya pendispersi hanya satu jenis cahaya atau cahaya dengan panjang gelombang tunggal yang mengenai sel sampel. Pada gambar di atas hanya cahaya hijau yang melewati pintu keluar. Proses dispersi atau penyebaran cahaya seperti yang tertera pada gambar.

3. Sel sampel berfungsi sebagai tempat meletakan sampel

- UV, VIS dan UV-VIS menggunakan kuvet sebagai tempat sampel. Kuvet biasanya terbuat dari kuarsa atau gelas, namun kuvet dari kuarsa yang terbuat dari silika memiliki kualitas yang lebih baik. Hal ini disebabkan yang terbuat dari kaca dan plastik dapat menyerap UV sehingga penggunaannya hanya pada spektrofotometer sinar tampak (VIS). Cuvet biasanya berbentuk persegi panjang dengan lebar 1 cm.

- IR, untuk sampel cair dan padat (dalam bentuk pasta) biasanya dioleskan pada dua lempeng natrium klorida. Untuk sampel dalam bentuk larutan dimasukan ke dalam sel natrium klorida. Sel ini akan dipecahkan untuk mengambil kembali larutan yang dianalisis, jika sampel yang dimiliki sangat sedikit dan harganya mahal.

4. Detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan mengubahnya menjadi arus listrik. Syarat-syarat sebuah detektor :

·         Kepekaan yang tinggi

·         Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi

·         Respon konstan pada berbagai panjang gelombang.

·         Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi.

·         Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi.

Macam-macam detektor :

·         Detektor foto (Photo detector)

·         Photocell, misalnya CdS.

·         Phototube

·         Hantaran foto

·         Dioda foto

·         Detektor panas

5. Read out merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat listrik yang berasal dari detektor.

Proses Absorbsi Cahaya pada Spektrofotometri

            Ketika cahaya dengan panjang berbagai panjang gelombang (cahaya polikromatis) mengenai suatu zat, maka cahaya dengan panjang gelombang tertentu saja yang akan diserap. Di dalam suatu molekul yang memegang peranan penting adalah elektron valensi dari setiap atom yang ada hingga terbentuk suatu materi. Elektron-elektron yang dimiliki oleh suatu molekul dapat berpindah (eksitasi), berputar (rotasi) dan bergetar (vibrasi) jika dikenai suatu energi.

            Jika zat menyerap cahaya tampak dan UV maka akan terjadi perpindahan elektron dari keadaan dasar menuju ke keadaan tereksitasi. Perpindahan elektron ini disebut transisi elektronik. Apabila cahaya yang diserap adalah cahaya inframerah maka elektron yang ada dalam atom atau elektron ikatan pada suatu molekul dapat hanya akan bergetar (vibrasi). Sedangkan gerakan berputar elektron terjadi pada energi yang lebih rendah lagi misalnya pada gelombang radio.

            Atas dasar inilah spektrofotometri dirancang untuk mengukur konsentrasi suatu suatu yang ada dalam suatu sampel. Dimana zat yang ada dalam sel sampel disinari dengan cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu. Ketika cahaya mengenai sampel sebagian akan diserap, sebagian akan dihamburkan dan sebagian lagi akan diteruskan.

 

Faktor-faktor yang sering menyebabkan kesalahan dalam menggunakan spektrofotometer dalam mengukur konsentrasi suatu analit:

• Adanya serapan oleh pelarut. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan blangko, yaitu larutan yang berisi selain komponen yang akan dianalisis termasuk zat pembentuk warna
• Serapan oleh kuvet. Kuvet yang ada biasanya dari bahan gelas atau kuarsa, namun kuvet dari kuarsa memiliki kualitas yang lebih baik.
• Kesalahan fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi sangat rendah atau sangat tinggi, hal ini dapat diatur dengan pengaturan konsentrasi, sesuai dengan kisaran sensitivitas dari alat yang digunakan (melalui pengenceran atau pemekatan).